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蛋白層析柱的柱效測定標(biāo)準(zhǔn)是什么?

更新時間:2022-03-16瀏覽:2087次

  蛋白層析柱一般用于純化蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)的方法的主要依據(jù)是各種大分子物質(zhì)之間理化特性的差異性。親和層析純化生物大分子通常采用柱層析的方法。親和層析柱一般很短,通常10cm左右。上樣時應(yīng)注意選擇適當(dāng)?shù)臈l件,包括上樣流速、緩沖液種類、pH、離子強(qiáng)度、溫度等,以使待分離的物質(zhì)能夠充分結(jié)合在親和吸附劑上。
 
  生物大分子和配體之間達(dá)到平衡的速度很慢,所以樣品液的濃度不易過高,上樣時流速應(yīng)比較慢,以保證樣品和親和吸附劑有充分的接觸時間進(jìn)行吸附。當(dāng)配體和待分離的生物大分子的親和力比較小或樣品濃度較高、雜質(zhì)較多時,可以在上樣后停止流動,讓樣品在層析柱中反應(yīng)一段時間,或者將上樣后流出液進(jìn)行二次上樣,以增加吸附量。
 
  樣品緩沖液的選擇也是要使待分離的生物大分子與配體有較強(qiáng)的親和力。另外樣品緩沖液中一般有一定的的離子強(qiáng)度,以減小基質(zhì)、配體與樣品其它組分之間的非特異性吸附。
 
  層析柱的柱效測定是在純化實驗中非常重要的步驟,也是我們得到準(zhǔn)確結(jié)果的保證。如果您是自己裝柱,建議您在使用前先做柱效測定來確定柱子的效果。另外,當(dāng)層析柱使用過一定次數(shù),或者發(fā)生實驗結(jié)果異常,柱子進(jìn)入氣泡,超壓等問題,我們也可以對柱子進(jìn)行柱效測定來判斷柱效是否正常。
 
  蛋白層析柱的柱效測定標(biāo)準(zhǔn):
 
  柱效測定主要通過計算理論踏板高度(HETP)和對稱性(As)來確定,Pulsetest是目前常用的測試方法,即使用少量的樣品流經(jīng)裝填好的層析柱中,通過儀器上的檢測器檢測實驗過程,實驗結(jié)束后對洗脫峰進(jìn)行分析。

 

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